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傳統(tǒng)定量PCR方法詳細(xì)說明!
更新時間:2020-08-14   點擊次數(shù):1192次

傳統(tǒng)定量PCR方法詳細(xì)說明!

 

實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。·
Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中,通過熒光信號,對PCR進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,所以成為定量的依據(jù)。

 

 檢測原理:

所謂實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

 

檢測方法:

1)內(nèi)參照法:在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時,內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

2)競爭法:選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增(其中一個引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。 3)PCR-ELISA法:利用第高辛或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗第高辛或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的。

信帆生物公司主要代理產(chǎn)品:
ELISA試劑盒:進(jìn)口ELISA試劑盒,國產(chǎn)ELISA試劑盒,人elisa試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒等。
培養(yǎng)基:微生物培養(yǎng)基,顯色培養(yǎng)基,BD培養(yǎng)基,gibco培養(yǎng)基等。
血清:胎牛血清,人血清,動物血清,NQBB,Hyclone,Gbico原裝血清 。
生物試劑:Amresco,Sigma,ABM,BIO-RAD,BD,ABCAM等進(jìn)口試劑。

標(biāo)準(zhǔn)品對照品:進(jìn)口對照品,進(jìn)口對照藥材,進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)品.
抗體:一抗,二抗,流式抗體等。
放免試劑盒:進(jìn)口放免試劑盒,國產(chǎn)放免試劑盒,進(jìn)口美國鳳凰等放免試劑盒。
實驗室代測服務(wù):放免代測,WB實驗,免疫組化代測,熒光定量PCR代測,病理細(xì)胞染色代測,生化實驗代測等。

 

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